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細胞工廠培養原代地鼠腎細胞工藝的建立及優化

發布時間: 2022-04-23  點擊次數: 217次

細胞工廠培養原代地鼠腎細胞工藝的建立及優化

目的  采用40層細胞工廠(40-layer cell factory, CF40)工藝培養原代地鼠腎(primary hamster kidney, PHK)細胞,優化乙腦減毒活疫苗的生產工藝。


方法  用不同濃度新生牛血清培養不同接種密度PHK細胞,比較各組PHK細胞數量,確定CF40工藝的PHK細胞接種密度和新生牛血清濃度。通過對比CF40和15 L轉瓶采用不同新生牛血清的PHK細胞培養情況,比較兩種工藝對新生牛血清的選擇性。對4個廠家CF40培養的PHK細胞數量進行單因素方差分析,判定對CF40的選擇性。


結果  CF40工藝的*條件為PHK細胞接種密度6.1×10ml-1、新生牛血清濃度6%。CF40工藝對新生牛血清的選擇性較低,能比轉瓶工藝更穩定地培養更多的PHK細胞。4個廠家CF40培養的PHK細胞數量之間的差異無統計學意義(F=0.23,P>0.05),對CF40選擇性低。


結論  采用CF40可以制備出滿足乙腦減毒活疫苗生產要求的PHK細胞。



正文

流行性乙型腦炎(乙腦)是經蚊蟲傳播的急性神經系統傳染病[1-2],全球每年報告約68 000 例乙腦病例,病死率約為30%,且在幸存者中,30%~50%會出現嚴重的神經系統和精神方面的后遺癥[3]。目前較為有效的預防方法是接種乙腦減毒活疫苗,且大量臨床研究證明乙腦減毒活疫苗具有良好的免疫原性和安全性[4-5]。隨著國家對預防用生物制品質量和生產工藝要求的逐漸提高,企業應采用可控性強、操作便利、節約生產成本和空間的生產工藝制備疫苗[6]。


目前,乙腦減毒活疫苗采用的是15 L轉瓶工藝,而乙腦病毒單一病毒收獲液的收量取決于原代地鼠腎(primary hamster kidney, PHK)細胞的質量,由于轉瓶工藝受控于人為因素較多,因此本試驗采用40層細胞工廠(40-layer cell factory, CF40)工藝培養PHK細胞,并對各關鍵工藝參數及材料進行優化,以制備符合生產要求、一致性更好的PHK細胞。

1

材料與方法

1.1

PHK細胞

PHK細胞由成都生物制品研究所有限責任公司(成都公司)病毒性疫苗一室使用成都公司動物室提供的10~14日齡黃金地鼠〔許可證號SCXK(川)2021-126〕制備。

1.2

主要試劑及儀器

新生牛血清分別購自蘭州榮曄生物科技有限責任公司、山西潤生大業生物材料有限公司、呼和浩特市草原綠野生物工程材料有限公司和美國Gibco公司,109培養基由成都公司配制,胰蛋白酶購自美國Gibco公司, CF40分別購自美國Corning公司、Nunc公司、FeiFanT公司和DHS公司;520 DI/REL蠕動泵購自斯派莎克工程(中國)有限公司,SHXJ-VIG(J)25瓶位轉瓶機購自蘭州飛控儀器總廠生化設備制造廠,Countstar IC1000全自動細胞計數儀購自上海睿鈺生物科技有限公司,XDS-1B倒置顯微鏡購自重慶重光實業有限公司。

1.3

CF40工藝中新生牛血清濃度和PHK細胞接種密度的選擇

將消化后的PHK細胞加入含不同濃度新生牛血清和0.1 mg /ml谷氨酰胺的109液體培養基,配制成為細胞懸液,添加NaHCO3調節pH至約7.4。共配制6組細胞懸液,PHK細胞接種密度分別為4.5×105、5.2×105、6.1×105、6.8×105、7.3×105、8.2×105 ml-1,每組3瓶,新生牛血清濃度分別為3%、6%、9%。將上述細胞懸液分別分裝約8 000 ml到Corning CF40中, 放入36~38 ℃孵室連續培養3 d,使用破窗錘將細胞工廠拆分成多個單層,用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況,并以全自動細胞計數儀進行細胞計數。如果存在幾個結果近似的較優新生牛血清濃度與PHK細胞接種密度的組合,則用這些組合重復試驗,并以全自動細胞計數儀進行細胞計數,每個組合試驗6次,選出*組合。

1.4

新生牛血清的選擇

分別使用不同廠家、同一廠家不同批號或不同廠家混合的新生牛血清制備8組細胞懸液,每組2瓶,1瓶約8 000 ml,含6%新生牛血清,PHK細胞接種密度為6.1×105 ml-1,轉入到1個Corning CF40;另1瓶約14 000 ml,含8%新生牛血清, PHK細胞接種密度為4.7×105 ml-1,平均分裝到7個15 L轉瓶。將CF40和15 L轉瓶放入36~38 ℃孵室連續培養3 d,以全自動細胞計數儀進行細胞計數,對比兩種工藝對新生牛血清的選擇性。

1.5

CF40的選擇

制備含6%新生牛血清,接種密度為6.1×105 ml-1的PHK細胞懸液,分別分裝到Corning、Nunc、FeiFanT、DHS的CF40中,體積均約8 000 ml,36~38 ℃孵室連續培養3 d,以全自動細胞計數儀進行細胞計數,比較各廠家的CF40對培養PHK細胞的適用性,每種CF40均測定9次。

1.6

數據統計和分析方法

使用Excel 2016軟件對不同PHK細胞接種密度、不同新生牛血清濃度在CF40上培養的PHK細胞數量繪制折線圖分析;使用SPSS Statistics 25.0軟件對兩個較優組合培養出的PHK細胞數量進行t檢驗,P<0.05表示差異具有統計學意義。分別計算CF40和15 L轉瓶使用不同新生牛血清培養的PHK細胞數量的方差與極差,比較兩種工藝對新生牛血清的選擇性;使用SPSS Statistics 25.0軟件對不同廠家CF40培養的PHK細胞數量進行單因素方差分析,P<0.05表示差異具有統計學意義。

2

結果

2.1

細胞工廠PHK細胞接種密度和新生牛血清濃度的選擇

由表1和圖1可知,CF40中最佳PHK細胞接種密度為6.1×105 ml-1,6%、9%新生牛血清明顯優于3%新生牛血清。對PHK細胞接種密度為6.1×105 ml-1時,6%、9%新生牛血清培養出的PHK細胞數量進行 檢驗,= -0.37,=0.722。在最佳PHK細胞接種密度下,6%、9%新生牛血清培養出的PHK細胞數量差異無統計學意義。從生產成本上考慮,確定*組合為6.1×105 ml-1細胞接種密度與6%新生牛血清濃度。

圖片
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2.2

對新生牛血清的選擇性

CF40使用不同新生牛血清培養的PHK細胞數量,標準差s1=0.06×109,極差R1=0.15×109,均值x?1=2.04×109;15 L轉瓶使用不同新生牛血清培養的PHK細胞數量,標準差s2=0.29×109,極差R2=0.77×109,均值x?2=1.44×109。s1s2,R1<R2,說明CF40培養的PHK細胞數量波動更??;x?1x?2,說明CF40培養的PHK細胞數量更多。綜上,CF40工藝對新生牛血清的選擇性較低,使用各廠家、批號的新生牛血清均能培養出數量比15 L轉瓶工藝多的PHK細胞,具體數據見表2。

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2.3

對CF40的選擇性

對4個廠家CF40培養的PHK細胞數量進行單因素方差分析,F=0.23,P=0.873。表明4個廠家CF40培養出的PHK細胞數量的差異無統計學意義,即PHK細胞對CF40的選擇性不高,具體數據見表3。

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3

討論

乙腦病毒屬于胞外病毒,病毒在細胞內完成復制組裝成熟之后會通過細胞膜進入到病毒維持液中,只需輕輕晃動就可以收集單一病毒收獲液,這也是使用細胞工廠制備乙腦減毒活疫苗的天然優勢。與15 L轉瓶工藝相比細胞工廠有較大的優勢,比如操作簡單、節省空間、可控性好、靜止培養更利于細胞貼壁以及提高PHK細胞生產的一致性等,已經廣泛應用于疫苗的生產和研發[7]。


新生牛血清在PHK細胞培養中起到十分重要的作用,它能終止胰蛋白酶消化,提供細胞生長所需的貼壁因子、促生長因子、免疫球蛋白、胰島素等營養物質[8]。目前市場上血清種類繁多,不同廠家及同一廠家不同批次血清質量存在差異,選擇合適的血清對細胞培養尤為重要[9]。本試驗采用了不同廠家或同一廠家不同批號或不同廠家混合的新生牛血清培養PHK細胞,試驗結果表明,CF40工藝對新生牛血清的選擇性低,這可能是和細胞工廠本身的制造工藝和培養方式相關,細胞工廠培養表面經過特殊處理,大大提高了細胞的吸附性,加之采用靜止培養方式,對新生牛血清中的貼壁因子要求不高[10]。綜合CF40工藝新生牛血清濃度和對血清的選擇性,每亞批CF40使用約500 ml新生牛血清能穩定地培養出約2.0×10PHK細胞,而15 L轉瓶工藝每亞批使用約1 100 ml新生牛血清,培養出的PHK細胞數目波動較大且遠少于CF40工藝。


綜上,CF40工藝可以穩定地培養出比15 L轉瓶工藝更多的PHK細胞,滿足乙腦減毒活疫苗生產需求,相比于目前不可控因素較多的轉瓶,不論是生產過程控制還是產品質量方面都會有提高。



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